Dans le but d'établir un traité de paix entre la France et l'Espagne, Don Carlos, Infant d'Espagne doit épouser Elisabeth de Valois, fille d'Henry II. Ils tombent amoureux dès leur première rencontre dans la forêt de Fontainebleau. Pour des raisons politiques, il est convenu que la princesse française épouse finalement le père de Carlos, Philippe II, fils de l'empereur Charles Quint et roi d'Espagne.

Des tensions politiques se développent en parallèle d'une histoire d'amour impossible. Les Flandres sont victimes de persécutions religieuses de la part de l'autorité catholique espagnole et elles revendiquent leur indépendance. Don Carlos prend parti contre le fanatisme religieux de son père. Cette rivalité père-fils culminant dans un duel, mènera les protagonistes à leur perte.

Rolando Villazón incarne le jeune prince se révoltant contre l'autorité familiale et politique du père. L'iconographie chrétienne est très présente sur scène, ce qui replace l'opéra dans le contexte religieux de l'Espagne du seizième siècle. La croix est le symbole du « pouvoir du père sur son fils », thème principal de l'opéra selon Willy Decker.